Las bacterias son los patógenos microbianos responsables de la mayor parte de las toxiinfecciones de origen alimentario en la UE.

La campilobateriosis se debe principalmente al consumo de alimentos contaminados con Campylobacter jejuni.

En los últimos años esta bacteria es una de las más frecuentemente implicadas en toxiinfecciones alimentarias en la UE, siendo la carne de ave su principal vehículo transmisor.

Se está llevando a cabo un gran esfuerzo investigador con objeto de establecer protocolos de trabajo eficaces que garanticen una correcta gestión de la bioseguridad a lo largo de toda la cadena alimentaria.

Estos programas de trabajo deben incluir el uso de productos desinfectantes eficaces frente a Campylobacter jejuni.

El presente trabajo tiene como principal objetivo el estudio de la eficacia del biocida OX-VIRIN®, desinfectante de élite, 100% biodegradable y que no genera residuos tóxicos, sobre el microorganismo Campylobacter jejuni.

La evaluación de la resistencia de Campylobacter jejuni NCTC 11351 en fase estacionaria de crecimiento a OX-VIRIN® se llevó a cabo en un medio rico en materia orgánica (3% de albúmina sérica bovina). Una vex realizados los tratamientos con OX-VIRIN® se utilizó una solución de tiosulfato sódico al 1% para neutralizar el biocida. El cultivo de este microorganismo se realizó en una cámara de incubación de atmósfera controlada en condiciones de microaerofilia (5% de oxígeno, 10% de dióxido de carbono y 85% de nitrógeno).

Con objeto de caracterizar la resistencia del microorganismo a OX-VIRIN®, se estudió la eficacia letal de este producto a concentraciones inferiores a las recomendadas por el fabricante, y se obtuvieron las gráficas de supervivencia. Los resultados obtenidos demostraron que la utilización del producto OX-VIRIN® a concentraciones de entre 0,5 y 5% y durante tiempos de contacto comprendidos entre 0,5 y 30 minutos resulta eficaz para la inactivación de más de 5 ciclos logarítmicos de la población de Campylobacter jejuni.

La gran eficacia biocida mostrada por OX-VIRIN® frente a Campylobacter jejuni pone de manifiesto que la utilización de este producto mediante protocolos de trabajo específicos puede ser de gran utilidad para garantizar la seguridad de los productos a lo largo de toda la cadena alimentaria.

Estudio

Introducción

Campylobacter es una de las bacterias más frecuentemente implicadas en toxiinfecciones alimentarias en la UE (EFSA, 2008).
La campilobacteriosis en humanos está causada principalmente por cepas de Campylobacter termotolerantes (EFSA, 2008).

La dosis infectiva de estas bacterias es generalmente baja y las especies más comúnmente asociadas a las infecciones en humanos son C. jejuni, seguida de C. coli y C. lari (ICMSF, 1996; EFSA, 2008).

Estos microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, siendo su principal reservorio el tracto gastrointestinal de los animales de sangre caliente (Oyarzábal et al., 1995).

Campylobacter spp. se ha detectado ampliamente en animales de abasto (aves, ganado vacuno, porcino, ovino), mascotas (incluyendo perros y gatos), aves salvajes y fuentes naturales de agua (EFSA, 2008).
Sin embargo, los animales raramente muestran signos clínicos a causa de la infección por esta bacteria.

La importancia de Campylobacter spp. radica fundamentalmente en su extraordinaria capacidad para contaminar rápidamente los alimentos, incluyendo la carne, la leche y los productos lácteos, los productos de la pesca y los vegetales crudos.

El consumo de carne de ave se ha señalado como el principal factor de riesgo de la transmisión de la enfermedad al hombre (Jorgensen et al., 2002; ACMSF, 2005; EFSA, 2008), aunque cabe destacar que la contaminación cruzada puede jugar un papel esencial en la difusión de esta bacteria.

La carne cruda de pollo puede contener niveles muy altos de contaminación (>107 UFC por canal) (Jorgensen et al., 2002), propiciando una contaminación cruzada durante la manipulación de alimentos en las cocinas de restaurantes y hogares.

Es muy común que Campylobacter se disemine por las cocinas durante la preparación de los alimentos. Los datos demuestran que el recuento de Campylobacter en las carcasas de los pollos permanece invariable durante más de 7 días a temperaturas de refrigeración (Jorgensen et al., 2002).

Se ha demostrado también que esta bacteria es capaz de sobrevivir durante más de 4 meses en el agua a bajas temperaturas (Hazeleger et al., 1998), en las plantas de procesado de alimentos (Cools et al., 2005) y en el ambiente (Park, 2002).

Dado que Campylobacter no es capaz de multiplicarse en presencia de niveles atmosféricos de oxígeno, es difícil que esta bacteria llegue a multiplicarse en los alimentos.

Por ello, para garantizar la seguridad alimentaria es fundamental la gestión eficaz de la bioseguridad con objeto de reducir o evitar la contaminación con este microorganismo en las granjas y en las plantas de procesado de los alimentos.

La diseminación de este microorganismo a nivel de granjas es muy rápida, y fundamentalmente debida a la transmisión horizontal (García et al., 2005), por lo tanto, las medidas de bioseguridad son esenciales para llevar a cabo un control eficaz.

Teniendo todo esto en cuenta, con objeto de diseñar programas eficaces para la gestión de la bioseguridad a lo largo de toda la cadena alimentaria, es necesario incluir el uso de desinfectantes eficaces frente a Campylobacter.

OX-VIRIN® es un desinfectante de amplio espectro que cumple con las siguientes normas de eficacia: UNE EN 1276:1998, UNE EN 1650:1998, UNE EN 1656:2000, UNE EN 1657:2007, UNE EN 13697:2001, UNE-EN 14675:2007 y UNE EN 14476. Este producto es 100% biodegradable y presenta nula toxicidad.

Además, presenta una acción rápida y eficaz a dosis bajas incluso a temperaturas de refrigeración.

Teniendo en cuenta las ventajas que ofrece el producto OX-VIRIN® se planteó la posibilidad de utilizar este desinfectante en programas de gestión de bioseguridad que incluyeran el control de Campylobacter.

Por ello, el objetivo fundamental de este trabajo fue evaluar la eficacia letal del desinfectante OX-VIRIN® sobre Campylobacter jejuni, a las concentraciones de trabajo normalmente recomendadas por el fabricante y en un medio de tratamiento rico en materia orgánica.

 

Material y métodos

Microorganismo: La cepa utilizada en este estudio fue Campylobacter jejuni NCTC 11351. La cepa fue suministrada por la National Collection of Type Cultures (Reino Unido) y mantenida en crioviales a -80ºC hasta el momento de su uso.

Medios de cultivo: Se utilizó como medio líquido de cultivo el caldo Brucella (Becton, Dickinson and Company, Sparks, EEUU) enriquecido con los agentes reductores sulfato de hierro, metabisulfito de sodio y piruvato de sodio (suplemento BBFBP).

Como medio sólido de propagación y recuperación se utilizó agar tripticasa soja suplementado con un 0,6% de extracto de levadura (Biolife, Italia) y un 0,1% de piruvato de sodio (Panreac, España) (TSAELP). La preparación de los medios se realizó según las indicaciones del fabricante.

Todos los medios, una vez preparados, se esterilizaron durante 20 minutos a 121ºC en autoclave y se almacenaron en refrigeración (4 ± 2ºC) hasta el momento de su uso.

Obtención de las suspensiones de trabajo: Para realizar este estudio se utilizaron microorganismos en la fase estacionaria de crecimiento. Para obtener las suspensiones se siguió la metodología que se explica a continuación: Se revitalizó el cultivo congelado realizando una siembra por agotamiento en estría y se inoculó, con una colonia aislada, un bote con 10 ml de caldo estéril, que se incubó 12 horas a 37ºC (precultivo).

Tras la incubación se sembró un frasco que contenía 50 ml de caldo estéril con 50 μl del precultivo. Este frasco se incubó en agitación a 37ºC hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento, tras 24 horas, que se correspondía con una concentración aproximada de 109 microorganismos/ml.

Tal y como se recomienda para el cultivo de este microorganismo, todas las incubaciones se llevaron a cabo en atmósfera de microaerofilia (5% oxígeno, 10% dióxido de carbono y 85% nitrógeno) en una cámara de incubación en atmósfera controlada (MACS VA 500 Don Whitley, Otley, United Kingdom).

Evaluación de la resistencia a OX-VIRIN®: los tratamientos biocidas se realizaron en 10 mL de agua estéril con un 3% de albúmina sérica bovina añadida (BSA) (Fluka, Biochemika). Dada la imposibilidad de esterilizar este medio en autoclave, se comprobó mediante recuento en placa que no contenía microorganismos contaminantes que pudieran enmascarar los resultados de las pruebas de resistencia, y por lo tanto no se consideró necesario esterilizar por filtración o por cualquier otro método adicional. Para cada tratamiento, se tomaron 2 mL de la suspensión en fase estacionaria de crecimiento de Campylobacter jejuni, se centrifugaron en tubos eppendorf a 10.000 g durante tres minutos y se resuspendieron en el medio de tratamiento. A continuación se inocularon los 2 mL en 8 mL del medio de tratamiento, se agitó la mezcla y se tomó una muestra de 100 μl para realizar la estimación del número inicial de microorganismos mediante recuento en placa por siembra en superficie. Seguidamente se añadió la cantidad de desinfectante necesaria para obtener en el tubo universal las diferentes concentraciones de trabajo (5, 2, 1, y 0.5 %). Tras agitar, se extrajeron muestras de 100 μl tras los tiempos de contacto prefijados (0.5, 1, 2, 5, 10, 20 y 30 minutos). Dichas muestras se depositaron directamente en un tubo eppendorf que contenía 900 μl de una solución de tiosulfato de sodio al 1% en agua destilada para la neutralización del desinfectante.

Posteriormente cada muestra se diluyó en MRD (Maximum Recovery Diluent) (Oxoid Basingstoke, Hampshire, England) y se procedió a su siembra en superficie en placas de TSAELP. Los recuentos de supervivientes se llevaron a cabo tras 72 horas de incubación a 37ºC en condiciones de microaerofilia. Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado en días independientes de trabajo y siempre utilizando suspensiones microbianas frescas.

Tal y como se muestra en el apartado de resultados, con objetivo de obtener mayor información acerca de la resistencia de C.jejuni a este desinfectante, se realizaron determinaciones puntales de resitencia a concentraciones inferiores a la señaladas anteriormente.

 

RESULTADOS

Todos los tratamientos llevados a cabo con concentraciones del 0.5% al 5% de OX-VIRIN® mostraron ausencia total de supervivientes tras todos los tiempos de exposición estudiados, incluyendo los tiempos más cortos (0.5 o 1 minuto).

La figura 1 muestra el número de supervivientes de C.jejuni tras exposiciones de 1 minuto a OX-VIRIN® a concentraciones del 0.5, 1, 2 y 5%.

Por otro lado, la figura 2 muestra los resultados correspondientes a las cuatro concentraciones de OX-VIRIN® testadas tras la exposición a diferentes tiempos comprendidos entre 0.5 y 30 minutos. Como se puede observar en las gráficas, tiempos de exposición al desinfectante de 0.5 minutos fueron suficientes para garantizar la ausencia total de supervivientes en todos los casos, lo que, dado el recuento inicial y el límite de detección de la técnica de recuento, indica una inactivación, de al menos, 5.7 ciclos logarítmicos en la población de C. jejuni. Esta gran eficacia del desinfectante OX-VIRIN® sobre C. jejuni fue muy probablemente debida a la sensibilidad de este microorganismo al estrés oxidativo. Puesto que en la formulación del producto OX-VIRIN® se incluyen como agentes activos compuestos con gran capacidad oxidante como el peróxido de hidrógeno, se podrían estar alterando las envolturas celulares del microorganismo de forma irreversible. Este hecho, podría facilitar el paso del ácido peracético (otro de los compuestos activos que incluye el producto) al interior celular, donde ejercería su acción antimicrobiana. Estos resultados estarían en concordancia con los presentados por otros autores (Humphrey, 1988; Sagarzazu, 2010) que ponían de manifiesto la extraordinaria sensibilidad de este microorganismo al estrés oxidativo, y por lo tanto al oxígeno y los productos de su reducción. Esta sensibilidad seguramente se debe a que Camylobacter spp. carece de muchos sistemas de regulación frente al estrés oxidativo (como SoxRS y OxyRS) presentes en otras bacterias como Salmonella spp. y E. coli. Sin embargo, debido a su condición de microaerófilo, Campylobacter spp. debe protegerse de alguna manera del estrés oxidativo y de los productos tóxicos resultantes del metabolismo del oxígeno. La proteína superóxido dismutasa SodB, elimina los aniones superóxido (Purdy, 1999). Este microorganismo posee también una catalasa (KatA) que degrada el peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno (Grant y Park, 1995) y la alquilhidróxidoperoxidasa AhpC, participa en la detoxificación reparando las moléculas que han sido peroxidadas (Baillon et al., 1999). A pesar de estos sistemas de protección, el desinfectante OX-VIRIN® mostró una gran eficacia frente a Campylobacter, probablemente debido a la acción sinérgica de sus componentes activos y a la estabilización de los mismos con un núcleo exclusivo.

Dado la enorme eficacia mostrada por OX-VIRIN® en las pruebas anteriormente descritas, se realizaron además ensayos cruzados para descartar posibles artefactos metodológicas que pudieran estar enmascarando los resultados, ya que en ocasiones se ha descrito cómo este microorganismo pierde viabilidad tras ser suspendido en determinados medios de laboratorio. Estos ensayos demostraron que los recuentos de C.jejuno en el medio de tratamiento de ausencia de OX-VIRIN® (agua destilada con un 3% de BSA) permanecían estables durante 30 minutos (datos no mostrados).

Por lo tanto, la pérdida de viabilidad observada en los experimentos previos puede considerarse debida únicamente a la acción del desinfectante.

Con objeto de caracterizar más profundamente la resistencia del microorganismo al desinfectante objeto de estudio, se investigó la eficacia letal de concentraciones entre 0.1 y 0.001% de desinfectante (figura 3), y se obtuvieron las gráficas de superviviencia (figura 4).

Como se puede observar en estas figuras, la exposición de C. jejuni durante 1 minuto a concentraciones de OX-VIRIN® de hasta 10 veces inferiores a las mínimas recomendadas por el fabricante lograban la inactivación, de al menos, 5.8 ciclos logarítmicos de inactivación.

Este hecho garantiza el éxito de la correcta desinfección en condiciones reales de trabajo
utilizando los programas de gestión de bioseguridad elaborados específicamente para el control de C.jejuni con este desinfectante.

Además, la gráfica de supervivencia en presencia de OX-VIRIN® al 0.01% representada en la figura
4 indica que tras 10 minutos de exposición a dicha concentración se produce un descenso de al
menos 6.9 ciclos logarítmicos en la población de C. jejuni.

En conclusión, las investigaciones descritas anteriormente ponen de manifiesto que el producto biocida OX-VIRIN®, utilizado a concentraciones de entre 0.5 y 5 %, resulta eficaz para la inactivación de más de 5 ciclos logarítmicos de la población de Campylobacter jejuni NCTC 11351 en fase estacionaria de crecimiento tras tiempos de exposición de, tan solo, 0.5 minutos. La gran eficacia biocida de este producto, junto con su facilidad de aplicación, inocuidad y biodegradabilidad, ponen de manifiesto su utilidad en los programas de control de Campylobacter a lo largo de toda la cadena alimentaria.